产品内容
组分 | 6068S（20T） | T6068L（50T） |
A. BiotinTUNEL Reaction Buffer | 1 mL | 2 × 1.25 mL |
B. TdT酶 | 20 μL | 50 μL |
C. Streptavidin-HRP | 20 μL | 50 μL |
D. Streptavidin-HRP稀释液 | 1 mL | 2×1.25 mL |
E. DAB显色液A | 100 μL | 250 μL |
F. DAB显色液B | 1 mL | 2×1.25 mL |
G. DAB显色液C | 50 μL | 125 μL |
H. Proteinase K (2 mg/mL) | 40 μL | 100 μL |
I. DNase I (2 U/μL) | 5 μL | 13 μL |
J. 10 × DNase I Buffer | 100 μL | 260 μL |
UE-T6068S/T6068L1. 有些细胞或组织，比如平滑肌核酸酶或聚合酶活性水平较高，使得DNA全部被切断，易导致假阳性。建议：取出细胞或组织后要立即固定并充分固定，以阻止这些酶的活性，同时设置阴性对照。2. 内源性过氧化物酶影响，建议：对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度。3. 固定液浓度过高或过低，导致组织中心部分固定效果不佳，而使得中心部细胞自溶、DNA链出现不规则断裂，产生假阳性。建议：推荐使用4%多聚甲醛。4. TdT 酶反应时间过长或Tunel反应过程中反应液发生蒸发或渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润。注意控制反应时间，并确保TdT 酶反应液能很好地覆盖样品。5. 石蜡、脂肪、血液、体液等都较易与染料结合，所以组织切片制作时要保持干净、脱蜡要彻底。6. 有些试剂或细胞存在自发荧光，选择染料时要避开自发荧光的颜色。◆为什么没有染上荧光？1. 固定不充分。固定液首选4%多聚甲醛，现用现配。不建议使用乙醇，乙醇固定液对组织的渗透力较弱，影响TUNEL标记效率.2. 细胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到达核内。细胞与冰冻切片，可用0.2% Triton X-100溶液通透5-30min，石蜡切片推荐使用蛋白酶K，37℃通透30 min；不同的细胞和组织所需要的通透时间略有不同，时间太长容易脱片，适当调整。3. 延长标记时间至2h，并适当增加TdT酶及dUTP的用量。4. 确定实验对象细胞有凋亡。准备一份DNase I处理的阳性对照，验证TdT酶反应是否正确进行。◆如何对细胞核进行复染？可在TUNEL反应结束后对细胞核进行染色。◆为什么荧光背景高？1. 支原体污染：可以使用支原体染色检测试剂盒验证。2. TdT 酶反应时间过长，可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液将TdT酶稀释2-5倍后再按照说明书操作，稀释后的TdT酶仅供当日使用。3. 处于高速分裂和增殖状态中的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA 断裂。建议：在非高增殖期取样检测；4. 有些试剂或细胞存在自发荧光，选择染料时要避开自发荧光的颜色。5. DAB 孵育时间过长，减少DAB 染色时间。6. Biotin-X-dUTP 的非特异性结合，在TdT 酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100 和1 mg/ml BSA 的PBS 洗三次。◆标记率低？1. 乙醇、甲醇或甲醛（市面上购买的甲醛大多含有甲醇）固定的样品标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失），采用推荐的固定液。2. 固定时间过长，导致交联程度过高，减少固定时间。3. 贴壁细胞如果使用药物诱导凋亡，会细胞皱缩，贴壁黏附力降低，导致凋亡细胞容易脱落。建议：在凋亡诱导结束后，可以对多孔板进行1000g离心5min，然后再吸出培养基并用PBS洗涤。如果没有适合的离心机，请注意操作轻缓，防止发生凋亡的细胞在洗涤时被洗去。后续整个操作也需要轻缓。◆在蛋白酶K中消化组织样品多久？大部分组织样品需要充分消化15分钟。最佳的培养时间根据组织类型和厚度而不同。脑组织比其他组织需要更长的蛋白酶处理时间。◆实验的组织切片应该多厚？老鼠肠、肾脏、肝脏、心脏和结肠厚度5–20 µm。
